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你已經是個成熟的細胞了,該學會自己做實驗了

2019/12/13提供者: 上海雅吉生物科技有限公司 人氣指數:118 進入該公司展臺

 實驗室里大家都埋頭做實驗,可為什么老板每次都罵我們,你都快30的人了這也不會那也不會,白長這么大了,栽培了你那么多年到頭來啥也指望不上。對此,我深感委屈,那個細胞我養了那么久,它還是那樣衣來伸手飯來張口,我有怪過誰么?

 

首先,這么大的細胞了,除了要自己學會傳代之外,鄙人對你們還有更高的要求,你該學會自己做實驗了。

 

細胞做實驗

 

來,先跟我說說細胞系和細胞株的區別。

 

細胞:原代培養物經過第一次傳代成功的細胞就是細胞系,可泛指一般可能傳代的細胞。而通過選擇法或克隆形成法從原代培養物或細胞系中獲得具有特殊性質或標志物的培養物稱為細胞株,也就是說,細胞株是用單細胞分離培養或通過篩選的方法,由單細胞增殖形成的細胞群。細胞株的特殊性質或標志必須在整個培養期間始終存在。

 

簡而言之,細胞系概念強調細胞系是首次傳代成功后的細胞群,細胞株概念強調細胞群的純度,認為細胞株是克隆的結果。

 

那再來說說,什么是穩定轉染和瞬時轉染。

 

細胞:穩定轉染,就是進入細胞的質粒整合入細胞基因組中,并能隨細胞分裂穩定傳遞下去。瞬時轉染表達時間短暫,外源基因導入整合基因組的幾率非常低,絕大部分以游離形式存在,不能隨細胞分裂而一同復制,導致最后拷貝數被稀釋,無法達到持續表達外源基因的目的。一般用轉染試劑進行質粒轉染,多是瞬時轉染。

 

瞬時轉染

 

非常好,你能區分什么時候需要構建穩轉株嗎?

 

細胞:需要構建穩轉株的,有這些類型:

(1) 長期在目的細胞中研究基因功能;

(2) 部分蛋白半衰期極長,瞬時RNA只能干擾表達,無法去除已經表達的目的蛋白,想要實現更好的基因干擾效果;

(3) 想要實驗更精準,篩選拷貝數適量的細胞進行實驗研究;

(4) 需要用誘導表達系統的,主要是一些致死基因或者是需要時空表達的;

(5) 需要用細胞做動物實驗的,比如裸鼠成瘤等。

 

以下實驗就不需要構建穩定株:

(1) 希望迅速觀察目的基因過表達或者干擾效果;

(2) 2-4天的瞬時表達已經可以達到具體的實驗目的,比如檢測兩個外源轉染的目的蛋白之間的相互作用;

(3) 細胞個體差異對實驗結果有影響。

 

基因過表達、干擾或基因敲除

 

那再來跟我匯報下什么是基因過表達、干擾或基因敲除?應該怎么選擇?

 

細胞:過表達就是把基因上調表達,即該基因被過度的轉錄、翻譯,最終基因表達產物超過正常水平。做過表達要比做干擾難度高一些,過表達需要表達出長鏈的mRNA,這一點比較困難,而干擾只需表達出短片段的shRNA即可。

 

一般情況下,如果本身就是高表達,你再做過表達就比較困難,某種程度上干擾更為重要,想說明一個基因對于一個事件是必須的,只有把它拿掉,事件終止(或程度減弱),才比較有說服力。但是,如果你的基因在細胞中基礎表達本身就不高的話,還是有必要來選擇過表達實驗來對其表型進行驗證的,否則實驗會受到質疑。

 

關于下調基因表達,一般來說干擾穩轉株能滿足實驗所需。但是,干擾穩轉株不能控制shRNA插入染色體的位置,染色體上的shRNA有時會丟失,另外shRNA也有脫靶效應,可能干擾了其他未知基因。還有就是,shRNA是與目的基因的mRNA作用而使之降解,是在RNA水平上的降低目的基因的表達。

 

此時,基因敲除穩轉株可以很大程度上規避這個問題。因為基因敲除穩轉株是在基因組水平上通過基因序列的改變使其基因功能喪失,在敲除細胞中通常不會檢測到靶蛋白的表達,而且敲除效果穩定,不能恢復,也就是永久性敲除了。但是基因敲除穩轉株缺點是操作周期長,費用多,效率低。如何選擇基因下調表達的方式,就要綜合考慮了。

 

那么同樣是穩定株,單克隆?混合克隆?要怎么選?

 

細胞:當需要去除細胞群體干擾因素的時候,推薦使用單克隆穩定細胞株,其基因組背景相對單一,對實驗結果干擾因素小。當進行系統生物學研究時,需考慮細胞群體因素,同時也是由于不同細胞個體差異大,而且不同整合位點的單克隆細胞株表現出來的細胞行為可能不一致,所以許多實驗使用混合克隆株更能去除細胞間差異造成的干擾。因此,選擇單克隆細胞株還是混合克隆細胞株,需要根據實驗目的而定。

 

好極了,怎么判別篩選的穩定株是單克隆呢?

 

細胞:如果外源片段含有熒光標記,可以直接使用流式細胞儀檢測其熒光是否均一;如果還有其它標簽,可以進行免疫熒光標記,再使用流式細胞儀觀察熒光分布是否出現均一峰值;

 

如果外源片段不含任何標簽或者熒光標記,則可以使用分子生物學比如Southern Blot的方法鑒定; 還可使用96孔板稀釋法篩選,得到的陽性克隆一般是單克隆。

 

可是我的細胞只會書本知識,沒有實戰經驗,不會自己基因過表達和敲減,不過幸好,還能求助我們

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